關鍵詞： 巨噬細胞極化 種植體表面改性 口腔科

　　作者：李慶帆，王佐林，同濟大學附屬口腔醫院口腔種植科

　　種植修復在臨床上得到越來越廣泛的應用，其可避免對余留牙齒的損傷，同時最大可能的恢復咀嚼功能，又能保證義齒的美觀性，相較于傳統義齒修復具有很多優點。種植體植入后不可避免地會引起機體的免疫炎癥反應。其作為一種生物材料，以往的觀點一直認為，種植體應該在匹配被替換組織力學性能的基礎上盡可能減少引起宿主免疫反應。

　　所以，現階段，臨床應用最廣泛的是惰性金屬鈦種植體。但是，一個為期19年的回顧性研究表明，仍有約47%的早期種植體失敗是由于種植后不良的炎癥反應導致的。所以，惰性金屬鈦的應用并不能完全滿足臨床要求。需要對鈦材料表面進行改性處理，使其具有調控機體免疫炎癥反應的作用，促進炎癥反應向有利于組織修復與再生的方向發展，保證種植體植入的成功及長期存留。

　　種植體植入后可引起機體的固有免疫反應，巨噬細胞作為固有免疫系統的第一道防線，在此過程中發揮重要的作用。近二十年的研究認為，巨噬細胞不僅具有吞噬及消化的作用，還可通過分泌趨化因子和細胞因子，在組織修復與改建中發揮重要作用。

　　巨噬細胞遷移至損傷部位后被激活，表現出與功能相關的兩種極化狀態：M1型與M2型，分別具有促進炎癥反應及抗炎、促進組織修復的作用。相關研究表明，種植體的表面物理化學特性和形貌結構會影響巨噬細胞的分化及功能。所以，理解種植體植入后巨噬細胞生物學行為的改變及種植體表面改性對巨噬細胞極化的影響至關重要。本文就種植體表面改性與巨噬細胞極化相關的研究做一綜述，以期為種植體表面設計與提升種植體的臨床應用效果提供新的思路。

　　1.種植體植入后的免疫反應

　　種植體植入后機體的免疫反應是復雜的。首先是形成創面，極短時間內，體液中的蛋白質迅速吸附在種植體表面；隨后，炎癥細胞浸潤，固有免疫系統的細胞是最先做出反應的細胞，其中單核細胞遷移至損傷部位后分化為巨噬細胞，之后形成富含生長因子、細胞因子及趨化因子的血凝塊，吸引間充質干細胞、成纖維細胞遷移至損傷部位，啟動組織愈合及骨再生的程序。

　　可見，除了間充質干細胞、成骨細胞等骨形成細胞參與骨結合之外，炎癥反應也是組織愈合過程中的必經步驟，其發生、發展和轉歸對骨結合的形成至關重要。例如，一項針對骨科植入物失敗的臨床研究表明，純鈦人工關節周圍過量的M1型巨噬細胞分化是植入材料失敗的重要相關因素，可導致周圍骨吸收和植入物的松動。生物材料如今已被廣泛的運用于醫學領域中。

　　關于生物材料與免疫炎癥反應的關系也逐步得到深刻的認識和理解。早在1988年，Anderson等最早論述了機體對生物材料的免疫炎癥反應，認為其最終結果是異物反應、肉芽組織形成和纖維包繞，對生物材料的成功和功能不利。相應地，當時認為理想的生物材料所具備的特征是生物惰性，盡量不激惹免疫炎癥反應。

　　隨著生物材料的發展與免疫炎癥反應研究的深入，目前對炎癥反應在生物材料愈合與組織再生中的作用有了全新的認識：宿主的免疫炎癥反應不僅是不可避免的，而且是促進組織愈合、再生所必須的。所以，為了促進骨愈合，提高種植體的成功率及骨結合的效率，植入材料的免疫調節作用應當在種植體設計時作為考慮因素。

　　巨噬細胞廣泛分布于組織中，是執行固有免疫的效應細胞。巨噬細胞起源于骨髓的單核母細胞，進入血液后形成單核細胞，當發生損傷時，遷移至損傷部位分化為成熟的巨噬細胞。以往的觀點認為，單核細胞是巨噬細胞的唯一來源，但現在越來越多的證據表明，許多組織固有的巨噬細胞起源于胚胎發育時期。

　　作為機體內重要的吞噬和抗原提呈細胞，巨噬細胞在早期免疫過程中發揮重要作用。此外，巨噬細胞在調節宿主對植入物的反應中也發揮關鍵作用。隨著非特異性蛋白吸附在種植體表面，單核細胞黏附并分化為巨噬細胞，活化的巨噬細胞分泌細胞因子，誘導淋巴細胞及其他類型的細胞參與免疫反應，從而調節炎癥反應，啟動植入物部位的損傷修復及改建。如果炎癥在2~4周內未被消除，巨噬細胞發生融合，形成大的多核的異物巨細胞（foreign body giant cells,FBGCs），并形成纖維瘢痕組織。

　　異物巨細胞釋放氧自由基、降解酶及酸，最終導致種植體失敗。巨噬細胞有很強的可塑性，可以針對外界微環境的信號分化為具有不同表型和功能的亞型，此過程稱為巨噬細胞極化。極化的巨噬細胞可以分為：經典活化的M1型巨噬細胞和選擇性活化的M2型巨噬細胞兩種類型。

　　M2型巨噬細胞又可進一步分為3個亞型：M2a、M2b和M2c型。M1型巨噬細胞多由γ-干擾素（IFN-γ）或脂多糖（LPS）誘導分化，分泌IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、TNF-α等促進炎癥的因子，引起機體的免疫炎癥反應。M2型巨噬細胞多由IL-4或IL-13誘導分化，主要分泌IL-4、IL-10、TGF-β等抗炎因子及CCL-13、CCL-18、CCL-22等趨化因子，具有抗炎及促進組織修復的作用。

　　M2型巨噬細胞也會分泌一些生長因子,包括血小板衍生生長因子（PDGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、轉化生長因子β（TGF-β），促進間充質干細胞的遷移、歸巢和成骨分化。同時，M1、M2型巨噬細胞在不同的刺激下又可相互轉化。即：M1型巨噬細胞在IL-4或IL-13刺激下可轉化為M2型，而M2型巨噬細胞在脂多糖、γ干擾素刺激下又可轉化為M1型。材料植入后，早期黏附的巨噬細胞多呈M1型分化，釋放多種促炎因子。隨后巨噬細胞向M2型分化，抑制炎癥發展，促進干細胞分化及組織修復、再生。所以，種植體周圍巨噬細胞的M2向分化程度決定了炎癥及組織再生修復的進展。

　　Thalji在一項系統評價中指出，在骨-生物材料整合領域的所有研究中，超過90%的研究集中在生物材料對間充質干細胞/成骨細胞生物學行為的影響，僅有不到10%的研究專注于生物材料的骨免疫反應。鑒于免疫炎癥反應的發展和結果將影響植入材料的成功與維持，所以理想的生物植入材料應具備免疫調節的作用，尤其是對巨噬細胞的生物學影響。

　　目前，生物材料調節巨噬細胞，發揮免疫調節作用的方式主要有2種：一是改變種植體表面的物理化學特性，二是聯合生物活性物質，調節種植體與宿主的反應。第一種方式，包括提高種植體的耐磨性能，調節表面潤濕性、電荷、粗糙度、表面化學或改變表面形貌。第二種方式主要通過構建生物活性材料表面，使材料表面功能化或添加聚合物涂層，釋放可溶的小分子物質或生物活性因子以達到調節免疫反應的作用。首先，種植體材料表面不同的物理特性可影響巨噬細胞的黏附、形態、遷移、炎性因子的分泌等，也可影響巨噬細胞的極化。

　　早在2004年就有研究者對不同粗糙度鈦表面對巨噬細胞的影響進行了實驗研究，設置了4個實驗組，分別為光滑表面、粗糙表面（包括3種：噴砂形成的粗糙表面、酸蝕形成的粗糙表面、噴砂酸蝕形成的粗糙表面即SLA表面），發現無論有無LPS刺激，粗糙表面更容易誘導巨噬細胞分泌炎癥因子（如IL-1α、IL-6和TNF-α，P＜0.05）。同時，表面形貌也會影響趨化因子的分泌，在LPS刺激下，SLA表面巨噬細胞分泌更多的趨化因子（P＜0.05），無LPS刺激時，巨噬細胞在SLA表面分泌趨化因子較少。此體外實驗表明，種植體表面形貌可以調節巨噬細胞炎癥因子及趨化因子的分泌。為了進一步驗證粗糙度對巨噬細胞的影響，Tan將J744A.1巨噬細胞分別接種在光滑鈦表面及大顆粒噴砂酸蝕的鈦表面，經過24~72h，發現無LPS刺激時，噴砂酸蝕表面巨噬細胞相比光滑表面表達更多IL-1β，IL-6表達較少。

　　當細胞受到LPS刺激時，2種形貌培養的細胞都高表達IL-1β和IL-6。以上研究表明，材料表面粗糙度是影響巨噬細胞功能的重要因素，在無外界刺激時，粗糙表面的巨噬細胞分泌更多的炎性因子。Luu等通過蝕刻技術，在鈦表面制備微米級及納米級寬度的凹槽（150nm~50μm），將小鼠巨噬細胞接種在這些帶有凹槽的鈦表面進行培養。發現這些溝槽有助于巨噬細胞的伸長，在400~500nm寬度的凹槽中，巨噬細胞的伸長達到頂峰，且抗炎細胞因子IL-10分泌量最高。這些研究結果表明，種植體表面形貌特征可通過調節巨噬細胞形態，進而調節巨噬細胞的功能。

　　研究者Ma等將純鈦材料分別在5、20V的電壓下進行陽極氧化，制備形成了具有不同管徑納米管的TiO2表面，體外實驗觀察巨噬細胞的反應，發現具有小管徑納米管的鈦表面可促進巨噬細胞向M2型即抑炎型極化，而具有大管徑納米管的鈦表面促進巨噬細胞向M1型即促炎型極化，進而影響種植體周圍組織愈合及骨組織再生，提示巨噬細胞在骨愈合的炎癥反應中發揮重要作用，且可以通過改變種植體表面形貌調節巨噬細胞極化來調控免疫反應。

　　據估計，骨的表面粗糙度約32nm，這使得納米材料在骨組織工程領域具有潛在的應用前景。探明種植體表面的理化因素對巨噬細胞黏附及極化的影響對于研制新型種植體具有重要作用。目前，對于改變材料表面物理特性影響巨噬細胞生物學行為的機制研究甚少，且當前的研究還主要集中在平面材料對細胞的作用，三維結構等特殊形貌對巨噬細胞的功能及在組織修復再生中的作用還未進行研究。

　　同時，人類組織來源的巨噬細胞是否存在此種關系還有待進一步驗證。其次，材料表面化學改性也是調節巨噬細胞的重要方式。免疫細胞與種植體作用是通過種植體表面特異性蛋白受體連接位點。經化學方式處理的種植體表面，蛋白質結合位點也會發生改變，進而影響免疫細胞的反應。

　　有研究證實，通過化學方法使種植體表面呈疏水型、親水型或離子型改變后，巨噬細胞的生物學行為會產生相應的變化。在親水型、陰離子表面培養巨噬細胞，細胞IL-10的表達明顯高于疏水性、陽離子表面，相反IL-8的表達量在親水性、陰離子表面降低。進一步的分析表明，親水性及陰離子表面可以抑制單核細胞黏附及巨噬細胞融合形成異物巨細胞的過程。

　　為了檢測表面化學特性對巨噬細胞極化及細胞因子分泌的影響，將巨噬細胞分別培養在幾種不同的表面。發現光滑鈦表面可誘導炎癥性M1型巨噬細胞活化，促進IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，相反親水的粗糙鈦表面可誘導M2型巨噬細胞活化，IL-4和IL-10分泌升高。這些研究結果表明，巨噬細胞培養在具有高表面潤濕性的鈦表面上，可誘導產生抗炎的環境，提高種植體的成功率。第三，將種植體表面與不同功能的涂層相結合，調節巨噬細胞極化也是較為常見的方式之一。

　　Li等通過等離子噴涂技術將二氧化鈰與羥磷灰石涂層結合，在其上培養小鼠RAW264.7巨噬細胞。結果發現，此種涂層在促進骨髓間充質干細胞成骨分化的同時可以誘導巨噬細胞向M2型極化，主要表現為M2型巨噬細胞標志物CD163和CD206表達上調，抗炎細胞因子（IL-10和IL-1ra）升高，M1型巨噬細胞表面標志物（CCR7和CD11c）和促炎細胞因子（TNF-α和IL-6）下調，活性氧的產生減少，有效促進二氧化鈰改性的涂層上巨噬細胞向M2型分化的趨勢。

　　最后，種植體表面的生物改性也是目前研究的熱點問題。通過負載生物分子，控制生物活性因子的釋放，實現調節巨噬細胞極化的作用，抑制炎癥進展，促進組織愈合。IL-10作為一種重要的抗炎因子被廣泛應用。Carvalho等將IL-10結合在葡聚糖的納米凝膠中，發現可以通過細胞因子的緩慢釋放，實現抗炎的作用。然而，IL-10在動物模型中可以發揮作用，但在人體臨床試驗中卻未獲得有效的結果。

　　Hachim等通過層層自組裝的方法在種植體表面加載納米厚度的殼聚糖及硫酸皮膚素的混合涂層，此涂層負載并可緩釋IL-4（一種可以誘導巨噬細胞向M2方向極化的因子），在體外可以促進M2型巨噬細胞的分化，減少M1型巨噬細胞的分化，同時小鼠體內實驗也證明在組織與種植體的接觸界面，M2型巨噬細胞的比例增加，M1型巨噬細胞的比例減少，從而減輕種植體周圍纖維囊的形成，促進組織的愈合。設計能夠序列釋放多種化學因子或生物分子的支架材料，通過調節巨噬細胞極化促進血管再生也有很大的前景。

　　Kumar等制備了能夠序列釋放多種細胞因子的仿生多肽水凝膠，通過釋放單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和IL-4，分別活化單核細胞及巨噬細胞。Spiller通過修飾去細胞骨支架，使其在早期促進巨噬細胞M1型分化，分化的M1型巨噬細胞分泌血管內皮生長因子VEGF，激活血管再生，然后持續釋放IL-4，促進巨噬細胞M2型分化，其分泌血小板來源的生長因子（PDGF-BB）促進后期的血管成熟。

　　IFN-γ及IL-4是分別通過物理吸附及生物素鏈霉素結合的方式負載在支架材料，實現了IFN-γ的早期釋放，IL-4的持續釋放。此種去細胞的骨支架有效地引發了從M1巨噬細胞到M2巨噬細胞的序列分化。大鼠皮下植入模型也證實了序列釋放IFN-γ及IL-4的骨支架可以有效調節炎癥反應，同時促進血管再生。種植體表面生物改性除了負載細胞因子，負載抗體、抗炎多肽也是常用的方法。

　　例如，廣泛應用的多肽促黑激素（α-MSH），具有抗炎的作用，研究者成功地將α-MSH結合到材料表面，并植入體內，觀察到活化的巨噬細胞數量減少，TNF-α分泌也有所減少，從而緩解了炎癥反應。除此之外，小干擾RNA（siRNA），miRNA也可被用來調節免疫反應，促進組織愈合，尤其是通過調節巨噬細胞的功能，提高其在組織再生中的應用。

　　4.巨噬細胞與間充質干細胞的相互作用

　　間充質干細胞可以分泌抗炎因子IL-10、VEGF，本身也具有免疫調節作用。Chen等的研究表明，骨髓來源的間充質干細胞條件培養基可以促進巨噬細胞及內皮細胞遷移至損傷部位參與組織修復。BMSCs也可釋放巨噬細胞炎性蛋白（MIP）和單核細胞趨化蛋白（MCP），促進單核、巨噬細胞的歸巢。同時，體外培養的間充質干細胞可以誘導M2型巨噬細胞標志物表達（如CD206，CD163，CD16）及分泌相關因子（IL-10和VEGF），并抑制M1型巨噬細胞標志物的表達（IFN-γ）。

　　反過來，巨噬細胞又會刺激間充質干細胞產生誘導其向M2型分化的因子（如IL-4和IL-13）。M2型巨噬細胞及其分泌的因子（IL-10、TGF-β1、TGF-β和VEGF）促進MSCs生長，而M1巨噬細胞及其相關的因子（IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ）抑制MSCs生長。

　　綜上所述，種植體骨結合是一個由炎癥反應引發的復雜生物學過程。種植體的表面特性不僅可以直接影響骨形成細胞，如破骨細胞、成骨細胞，調節骨代謝，也可以間接作用于骨免疫系統，調節巨噬細胞、T淋巴細胞等分泌相應細胞因子參與組織的修復與再生。且兩種作用形式是相互交叉影響的，從這點上也說明了骨免疫系統和骨組織代謝的偶聯關系，也肯定了骨免疫學在骨代謝研究中的重要性。

　　巨噬細胞作為固有免疫的重要組成部分，同時又是種植體植入機體后最先做出反應的細胞，其可塑性使其在組織修復與再生中發揮重要的作用。所以，研究巨噬細胞在機體免疫炎癥反應中的作用以及種植體的不同特性對巨噬細胞的生物學行為的影響，具有極為重大的理論意義與臨床價值。在進行種植體設計時，要充分考慮骨免疫系統的作用，平衡炎癥與抗炎之間的關系，才能保證種植體獲得良好的效果。隨著種植體表面改性與免疫調節的作用逐漸引起重視，今后的發展趨勢是在鈦種植體表面構建具有低免疫原性及免疫調節功能的生物活性涂層，研發具有免疫調節能力的新型種植體，促進骨形成，實現早期和長期穩定的骨結合，提高種植體成功率及長期存留率。

　　來源：李慶帆,王佐林.鈦種植體表面改性對巨噬細胞極化影響的研究進展[J].口腔頜面外科雜志,2019,29(04):224-229